彩02

培养细胞中的线粒体提取

导语:分离线粒体的原理:从任何组织或细胞中分离线粒体的关键步骤,大致相同

——使用杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer

本文仅用于研究用途

一、介绍

    分离线粒体的原理:从任何组织或细胞中分离线粒体的关键步骤,大致相同:(1)通过机械和/或化学手段使细胞破裂,(2)低速离心以除去杂质和较大的细胞器,随后以较高的速度离心,以分离收集的线粒体。 此种线粒体分离方法可以满足大多数应用。 下述步骤详述提取步骤,旨在提供能够获得尽可能高产量和酶活性的线粒体。

二、实验方案(详见6操作步骤)

1、冻融法弱化细胞膜,以5.0mg / ml悬浮于试剂A中,置于冰上10分钟。

2、使用杜恩斯研磨器 WHEATON Dounce Homogenizer 匀浆,破坏细胞膜

3、SPIN 1: 4°C温度下1000g离心力,离心10分钟,收集上清液#1. 重复收集上清液#2

4、SPIN 2: 4°C温度下12,000g离心力,离心15分钟,弃上清,保留沉淀。

5、加入C试剂,蛋白酶抑制剂,使用涡旋振荡器重悬沉淀,分装-80°C保存

6、线粒体测定:蛋白质浓度,OXPHOS活性,Western Blot

三、关键试剂和仪器

1、试剂A 50ml

2、试剂B 50ml

3、试剂C 10ml

4、杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)

5、涡旋混合器VORTEX3000

6、低温高速离心机BIOCEN 22R
 

四、存储条件

试剂A/B/C, 4°C存储
 

五、其他试剂和仪器

 

1、双蒸水

2、蛋白酶抑制剂(PI)

3、BCA蛋白质分析

4、2ml离心管

5、天平等实验室常规设备

 

六、操作步骤

线粒体制备遵循三个简单的步骤:细胞破裂,离心去除杂质和大的细胞器,离心分离线粒体。 以下是从培养的人类细胞中制备线粒体的指导原则。 试剂和样品应尽可能冷藏。 建议使用4 x 150 mm的融合细胞平板(约4x107个细胞)。

1、收集细胞:在贴壁细胞的情况下,它们可以用细胞提取器收集,并通过在1000g离心沉淀。 每个平板通常产生2mg全细胞蛋白质。 这可通过蛋白质测定来检查。

2、使用冻融发弱化细胞膜

3、按照5mg蛋白加入1ml试剂A量进行计算,在2ml离心管中重悬细胞

4、冰上放置10min


破坏细胞膜:

5、将细胞转入预冷的杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)中。.

6、使用LOOSE杵,匀浆30次

7、转移匀浆液到2ml离心管中.

 

SPIN 1:

8、 4°C温度下1000g离心力,离心10分钟

9、收集上清液#1.

10、加入试剂 B 重悬沉淀,加入体积与第3步等同.

11、重复破坏细胞膜和 SPIN1中的 第8步.

12、收集上清液,记作(SN) #2,丢弃沉淀

13、充分混合 #1 & #2, 加到2ml离心管中,如果超过2ml 请均分到两个离心管中

 

SPIN 2:

14、4°C温度下12,000g离心力,离心15分钟

15、弃上清,保留沉淀

16、使用500μl试剂C,重悬沉淀,同时加入蛋白酶抑制剂

17、分装-80°C保存备用.

 

七、常见问题分析

 问题

 可能引起原因

 解决方法

 线粒体离心沉淀很少

 没有充分将细胞破碎

 增加匀浆次数

 大量的细胞色素C

 细胞过度溶解/细胞不新鲜

 减少匀浆次数/选取新鲜细胞

 线粒体纯度低

 存在污染

 降低SPIN2离心力到6000g

杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer

VORTEX3000

低温高速离心机BIOCEN 22R

 

附录一(参考 ab110171 ):

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